Мышиная модель диабет

Мышиная модель диабет

Targeted Inhibition of Calpain Reduces Myocardial Hypertrophy and Fibrosis in Mouse Models of Type 1 Diabetes
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3198063/

Недавно мы показали, что активация кальпаина-1 способствует апоптозу кардиомиоцитов, вызванному гипергликемией. Это исследование было проведено для исследования того, может ли целенаправленное разрушение кальпаина уменьшить гипертрофию миокарда и фиброз в мышиных моделях диабета типа 1.

Диабет у мышей индуцировали инъекцией стрептозотоцина (STZ), а мышей OVE26 также использовали в качестве диабетической модели типа 1. Функция calpain была генетически манипулирована специфическим кардиомиоцитом нокаутом Capn4 у мышей и использованием трансгенных мышей кальпастатина. Гипертрофия миокарда и фиброз были исследованы через 2 и 5 месяцев после инъекции STZ или у диабетических мышей OVE26 в возрасте 5 месяцев. В условиях высокого уровня глюкозы также исследовали культивируемые изолированные клетки сердечной фибробласты мыши для взрослых.

Активность кальпаина, площади поперечного сечения кардиомиоцитов и осаждение коллагена миокарда значительно повышались как при сердечно-сосудистых заболеваниях, так и при сердечно-сосудистых заболеваниях, вызванных СТЗ, и они сопровождались повышенной экспрессией гипертрофических и фиброзных коллагеновых генов. Дефицит Capn4 или избыточная экспрессия кальпастатина снижают гипертрофию миокарда и фиброз в обеих диабетических моделях, что приводит к улучшению функции миокарда. Эти эффекты были связаны с нормализацией ядерного фактора активированного Т-клеточного ядерного фактора-κB и матричной металлопротеиназы (MMP) в диабетических сердцах. В культивируемых сердечных фибробластах высокая активность, индуцированная глюкозой, и активность MMP были предотвращены ингибированием кальпаина.

Гипертрофия миокарда и фиброз у мышей с диабетом ослабевают путем уменьшения функции калпаина. Таким образом, целенаправленное ингибирование кальпаина представляет собой потенциальную новую терапевтическую стратегию для изменения диабетической кардиомиопатии.

Сердечно-сосудистые осложнения являются основной причиной заболеваемости и смертности от диабета (1). Диабет не только усугубляет сердечную травму после инфаркта миокарда или ишемии / реперфузии (2-4), но и непосредственно повреждает сердце, что приводит к уникальной диабетической кардиомиопатии, независимо от ишемической болезни сердца, гипертонии и гиперлипидемии (1,5). Диабет характеризуется гипергликемией. Корреляция между гипергликемией и кардиомиопатическими изменениями, такими как гипертрофия сердца, интерстициальный фиброз и апоптоз кардиомиоцитов, установлена ​​долго (6). Однако основные клеточные механизмы, ответственные за эти аномалии, остаются частично понятными.

Кальпаны представляют собой Ca2 + -зависимые внутриклеточные протеазы. Двумя из наиболее известных видов калпаина являются μ-calpain (calpain-1) и m-calpain (calpain-2). Эти изоформы представляют собой гетеродимеры, состоящие из каталитических субъединиц ~80 кДа (кодируются генами Capn1 и Capn2 соответственно) и регуляторной субъединицей ~ 30 кДа (кодируется Capn4) (7-9). Регуляторная субъединица необходима для стабильности μ и m-calpain и каталитической активности. Нокаут Capn4 у мышей отменил активность calpain-1 и calpain-2, что привело к эмбриональной летальности (10). Активность Calpain-1 и calpain-2 жестко контролируется эндогенным ингибитором кальпастатина. Кальпастатин, по-видимому, специфичен для этих двух изоформ калпаина, но не ингибирует любую другую протеазу (7). Сверхэкспрессия кальпастатина была успешно использована для блокирования активации кальпаина как in vitro, так и in vivo (11-14). Хотя его точная физиологическая функция неясна, кальпаин играет продемонстрированную роль в сердечно-сосудистых заболеваниях (14,15).

Исследования показали многообещающие улучшения в сердечной функции после ингибирования активности кальпаина, будь то в моделях инфаркта или ишемии / реперфузии (14-17). Недавно мы продемонстрировали, что активность кальпаина увеличивается в кардиомиоцитах с высокой глюкозой и в краткосрочном стрептозотоцине (STZ) -индуцированном диабете (14). Фармакологическое ингибирование кальпаина уменьшало апоптоз в обоих методах лечения. Кроме того, исследования выявили жизненно важные роли кальпаина в регулировании активности ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT) и ядерного фактора-κB (NF-κB), два фактора транскрипции, часто участвующих в развитии гипертрофии и фиброза (18-21 ). Поэтому мы предположили, что ингибирование кальпаина может оказывать защитное действие на миокард при диабете. Насколько нам известно, ни одно исследование ранее не изучало роль кальпаина при гипертрофии сердца и фиброзе в диабетических условиях. Здесь мы показываем, что кардиомиоцитарно-специфичная делеция кальпаина или избыточная экспрессия кальпастатина уменьшают кардиомиопатию у мышиных моделей диабета типа 1.

Это исследование соответствует Руководству по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованному Национальными институтами здравоохранения США (публикация NIH № 85-23). Все экспериментальные процедуры были одобрены Подкомитетом по использованию животных в Университете Западного Онтарио, Канада. В Лаборатории Джексона были приобретены пары размножения мышей C57BL / 6 и FVB (Cg) -Tg (Ins2-CALM) 26OveTg (Cryaa-Tag) 1-трансгенных мышей PveJ (OVE26), мышиная модель диабета 1 типа. Мыши, несущие целевой аллель Capn4PZ, содержащий сайты loxP, фланкирующие экземы экзистенциального кодирования и мыши с специфической к кардиомиоцитам экспрессией Cre recombinase (Tg-Cre) под контролем тяжелой цепи α-миозина (α-MHC), были получены, как описано ранее (22, 23). Трансгенные мыши, сверхэкспрессирующие кальпастатин (Tg-CAST), приводимые в действие промотором цитомегаловируса, были предоставлены доктором Лораном Бодом (Национальный институт де-ла-де-ла-Речерче Медикале, Париж, Франция) через Европейский архив мутантов мышей (11).

Диабет был вызван у взрослых самцов мышей (2 месяца) путем последовательной перитонеальной инъекции стрептозотоцина (STZ, 50 мг / кг в день) в течение 5 дней. Через семьдесят два часа после последней инъекции STZ цельная кровь была получена из хвостовой вены мыши, а случайные уровни глюкозы были измерены с использованием системы мониторинга уровня глюкозы в крови OneTouch Ultra 2 (LifeScan, Milpitas, CA). Мышей считали диабетическими и использовали для исследования, только если они имели гипергликемию (≥15 ммоль / л) через 72 часа после инъекции СТЗ. Мыши, обработанные цитратным буфером, использовали в качестве недиабетических контролей (уровень глюкозы в крови

Сердечные фибробласты были выделены, как описано ранее (24), с некоторыми изменениями. Короче говоря, мышиные желудочковые ткани вырезали, промывали холодным PBS и затем помещали в изолирующий буфер. Индивидуальные желудочки измельчали ​​и расщепляли в течение 90 мин в изолирующем буфере, содержащем коллагеназу типа 2 и дозирование-II. Фибробласты собирали центрифугированием, ресуспендировали в модифицированной Дульбекко среде Eagle, содержащей 10% FBS, и высевали на чашки для культивирования тканей. Все фибробласты использовались с первых двух до четырех поколений.

Содержание коллагена и площадь поперечного сечения кардиомиоцитов оценивали, как описано в нашем недавнем отчете (25).

Активность Calpain определяли с использованием флуоресцентного субстрата N-сукцинил-LLVY-AMC (Cedarlane Laboratories) (12-14) и кайзен-зимографией, как описано ранее (26).

Активность NFAT и NF-κB определяли с использованием наборов для анализа на основе фильтрующего фактора на основе ELISA в соответствии с инструкциями производителя (Signosis).

Оценку активности глобальных матричных металлопротеиназ (MMP), MMP-2 и MMP-9 оценивали с использованием коммерческих наборов (AnaSpec), соответственно.

Рост клеток оценивали с использованием анализа 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолия (МТТ) и анализа пролиферации клеток ДНК бромдезоксиуридина (BrdU) (Millipore) в соответствии с инструкциями производителя ,

RT-PCR в реальном времени проводили для анализа экспрессии мРНК для тяжелой цепи Capn4, β-миозина (β-MHC), предсердного натрийуретического пептида (ANP), коллагена I и III и GAPDH, как описано в нашем недавнем отчете (25).

Максимальные и минимальные первые производные силы (+ dF / dtmax и -dF / dtmin) по мере того, как скорость сжатия и релаксации оценивалась, как описано ранее (12, 25).

Мышам анестезировали коктейлем кетамин / ксилазин и проветривали. Сундук был открыт, а катетер PVS-1212B-4518, 1.2F с линзой Scisense был непосредственно вставлен в левый желудочек (LV) через вершину для измерения давления и объемов LV, как мы описали недавно (27, 28). Данные были записаны системой PVV ADVantage (модель FY997B, Лондон, ON, Канада). Все гемодинамические параметры были проанализированы с помощью программного обеспечения записи данных LabScribe2 (CB Sciences, Dover, NH) в соответствии с инструкциями производителя.

Все данные были представлены как среднее ± SD. ANOVA с последующим тестом Newman-Keuls была выполнена для многогрупповых сравнений. Значение Р

Чтобы установить кальпаин в качестве протеазы, представляющей интерес для понимания механизмов кардиомиопатии в диабетическом сердце, мы измеряли активность кальпаина в сердечных тканях у пациентов с сахарным диабетом STZ и OVE26. В соответствии с нашим недавним докладом в краткосрочном STZ-индуцированном диабете (14), как сердца STZ, так и OVE26 показали значительное увеличение активности кальпаина над недиабетическими сердцами (фиг.1A и B). Активация кальпаина была дополнительно подтверждена усилением расщепленного α-спектрина в диабетических сердцах (фиг.1С). Повышающая активность кальпаина не была вызвана изменениями отношения кальпаина к кальпастатину, поскольку уровни белка и мРНК кальпаина-1 и кальпаина-2, а также кальпастатина не были значительно изменены в диабетических сердцах (фиг.1D и Дополнительная фиг.1). Эти результаты подтверждают связь между увеличением активности кальпаина и диабетом.

Calpain активность и экспрессия белка у STZ-инъецированных и мышей OVE26. Активность ферментативной калпаина измеряли в ложных и обработанных STZ сердцах (A) или сердцах дикого типа (WT) и OVE26 (B). C: расщепление α-спектрина (120/150 KD) определяли в фиктивных и STZ-инъецированных сердцах методом Вестерн-блот-анализа. Top: представительное вестерн-блоттинг для расщепленных фрагментов α-спектрина из четырех из восьми разных сердец в каждой группе; bottom: количественное определение расщепленных фрагментов α-спектрина относительно GAPDH. D: Представительная вестерн-блот для белков calpain-1, calpain-2 и GAPDH из четырех из восьми сердец в каждой группе (фиктивные и STZ-индуцированные сердца). D1 и D2 — это количественное определение белка calpain-1 и calpain-2 по сравнению с GAPDH. Данные — среднее ± SD; n = 8. KD, kDa. * P

Чтобы исследовать роль кальпаина, мы сгенерировали мышей с кардиомиоцитарно-специфическим нарушением кальпаина путем скрещивания с floxed мышей Capn4PZ с трансгенными мышами, сверхэкспрессирующими Cre под контролем промотора α-MHC (Tg-Cre). Все мыши, используемые в этом исследовании, включая средства контроля, были однопометниками одного поколения. ПЦР-анализ хвостовой ДНК подтвердил нецелевые (Capn4 + / +), либо гомозиготные (Capn4PZ / PZ), либо гетерозиготные (Capn4 + / PZ) для флоксированного гена Capn4 и транс-транс (дополнительный рисунок 2A). Мыши, гомозиготные или гетерозиготные для флоксированного гена Capn4 и положительные для трансгена α-MHC-Cre, были идентифицированы как потенциальные гомозиготные (Capn4 — / -) или гетерозиготные нокауты (Capn4 +/-) соответственно. Чтобы подтвердить снижение экспрессии Capn4 в сердце, мРНК Capn4 анализировали в мышах Capn4 + / + и Capn4 — / -, используя праймеры, специально усиливающие удаленную область мРНК Capn4. Мемориал миокарда Capn4 был снижен на 78% у мышей Capn4 — / — по сравнению с мышами Capn4 + / + (фиг.2А и В). Напротив, уровни мРНК Capn4 в тканях легких были сходными между мышами Capn4 — / — и Capn4 + / + (фиг.2A и B), поддерживая кардио-специфический нокаут Capn4. Чтобы дополнительно подтвердить, что делеция Capn4 была ограничена в кардиомиоцитах, уровни мРНК Capn4 были значительно уменьшены у изолированных кардиомиоцитов мышей Capn4 — / -, тогда как их уровни были сопоставимы между фибробластами Capn4 — / — и Capn4 + / + (фиг.2C ). Поскольку регуляторная субъединица Capn4 необходима для стабильности и протеолитической активности каталитических субъединиц calpain-1 и calpain-2 (10), удаление Capn4 приводит к нарушению активности calpain-1 и calpain-2. Действительно, казеин-зимографический анализ тканей миокарда показал устойчивое снижение активности калпаин-1 и калпаин-2 в Capn4 — / — по сравнению с мышами Capn4 + / + (рис. 2D), что подтверждает функциональный нокаут Capn4. Подобно экспрессии мРНК Capn4, активность калпаин-1 и калпаин-2 не снижалась в тканях Capn4 — / — легкого (рис. 2D).

Характеристика мышей с кардиоспецифическим нокаутом Capn4. A: Представитель RT-PCR для Cre и млекопитающих Capn4 у двух из шести мышей в каждой группе. Cre mRNA была обнаружена в Capn4 — / — сердцах (дорожки 3 и 4). Уровни мРНК Capn4 были значительно снижены в сердцах Capn4 — / -. Напротив, мРНК Capn4 не уменьшалась в Capn4 — / — легких. B: мРНК Capn4 определяли количественно RT-PCR в реальном времени в Capn4 + / + и Capn4 — / — сердцах (B1) и тканях легких (B2). C1 и C2 представляют собой количественную оценку мРНК Capn4 в изолированных кардиомиоцитах (C1) и сердечных фибробластах (C2) у мышей Capn4 + / + и Capn4 — / -. D: Репрезентативная казеиновая зимография для упражнений calpain-1 и calpain-2 из двух из шести сердец и легких, соответственно, демонстрирующая снижение активности кальпаина-1 и кальпаина-2 в сердцах Capn4 — / -, но не в легких. Данные — среднее ± SD; n = 5-9. * P

Мыши Capn4 — / — обычно росли во взрослую жизнь без очевидных проблем со здоровьем. У недиабетических мышей не было различий в весе сердца, массе тела и у мышей Capn4 + / + или Capn4 — / — (дополнительная таблица 1). Тест на толерантность к глюкозе не показал различий между Capn4 + / + и Capn4 — / — (дополнительный рисунок 2B). Гистологический анализ не выявил патологических изменений сердец Capn4 — / — (Дополнительный рисунок 2C). Эти наблюдения свидетельствуют о том, что делеция Capn4, специфичная для кардиомиоцитов, не вредна для сердца и исключает потенциальные неблагоприятные эффекты экспрессии Cre в сердцах мышей Capn4 — / -.

Мышей Capn4 — / — и Capn4 + / + оказывались диабетическими с STZ. Через два месяца после инъекции STZ мыши проявляли гипергликемию, гиперфагию, полидипсию и снижение массы тела по сравнению с животными, обработанными транспортным средством. Не было выявлено различий в массе тела, весе сердца и концентрации глюкозы в крови между мышами Capn4 — / и Capn4 + / + (дополнительная таблица 1). В соответствии с нашим недавним докладом (25) гистологический анализ областей поперечного сечения кардиомиоцитов у мышей дикого типа показал увеличение размера кардиомиоцитов в диабетических и недиабетических сердцах, что свидетельствует о гипертрофии кардиомиоцитов. Однако размеры кардиомиоцитов не были увеличены в диабетических сердцах Capn4 — / — (рис.3А). Кроме того, измерения генной экспрессии диабетических сердец показали повышенную регуляцию как мРНК ANP, так и β-MHC (фиг.3B и C), что является дополнительным доказательством гипертрофического фенотипа. Хотя оба гена были также активированы в Capn4 — / — диабетических сердцах, эти увеличения были значительно снижены по сравнению с мышами дикого типа (фиг.3В и С). Интересно отметить, что при сравнении сердечно-сосудистых сердец Capn4 — / — и Capn4 + / + не было различий в размерах кардиомиоцитов и гипертрофических генах (фиг.3В и С). Эти результаты показали, что нокаут Capn4 предотвращает гипертрофию миокарда в мышиной модели STZ-индуцированного диабета типа 1. Удаление Capn4 также уменьшало активность миокарда каспазы-3 (рис. 3D) и фрагменты ДНК, связанные с цитоплазматическим гистоном (дополнительный рисунок 3), что указывает на снижение апоптоза, что согласуется с нашим недавним отчетом (14). Аналогично, через 5 месяцев после инъекции STZ размер кардиомиоцитов и экспрессия гипертрофических генов были снижены в Capn4 — / — по сравнению с сердцами Capn4 + / + (дополнительные фиг.4A и B), что указывает на то, что защитные эффекты делеции Capn4 могут поддерживаться при диабетической кардиомиопатии ,

Оценка гипертрофии сердца у диабетиков Capn4 — / — (нокаут [KO]) и мышей Tg-CAST. Сердечную гипертрофию определяли путем измерения площади поперечного сечения кардиомиоцитов и экспрессии гипертрофических генов (ANP и β-MHC). A-D: Дефицит Capn4 уменьшил площади поперечного сечения кардиомиоцитов (A), уровни мРНК ANP ​​(B) и β-MHC (C) и активность каспазы-3 (D) в диабетических Capn4 — / — сердцах. E-H: площади поперечного сечения кардиомиоцитов (E), уровни мРНК ANP ​​(F) и β-MHC (G) и активность каспазы-3 (H) уменьшались в сердцах диабетического Tg-CAST. Данные — среднее ± SD; n = 8. * P

Активность Calpain-1 и calpain-2 плотно и конкретно регулируется кальпастатином (8). Сверхэкспрессия кальпастатина была успешно использована для блокирования активации кальпаина как in vitro, так и in vivo (11-14). Для дальнейшего понимания роли кальпаина при диабетической сердечной гипертрофии мы превратили трансгенных мышей кальпастатина (Tg-CAST) и их однопометников дикого типа с диабетом методом STZ и оценили гипертрофические изменения сердца через 2 месяца после инъекции STZ. У недиабетических мышей не было различий в размерах кардиомиоцитов и экспрессии гипертрофических генов в сердцах Tg-CAST и мышей дикого типа (рис. 3E-G). У диабетических мышей избыточная экспрессия кальпастатина не коррелировала с измененными уровнями глюкозы в крови и весом тела и сердца (дополнительная таблица 1); однако индуцированное диабетом увеличение площади поперечного сечения кардиомиоцитов, экспрессии ANP и β-MHC и активности каспазы-3 были значительно ослаблены в Tg-CAST по сравнению с мышами дикого типа (фиг.3E-H). Эти результаты далее утверждают, что ингибирование кальпаина снижает гипертрофию миокарда у пациентов с диабетом, индуцированных STZ.

Чтобы исключить возможность того, что лечение СТЗ имело системные действия, не зависящие от разрушения β-клеток, мы повторили эти эксперименты в модели диабетической мыши типа OVE26 типа 1 и пересекли их с мышами Tg-CAST, чтобы ингибировать активность кальпаина. Экспрессия трансгенного кальпастатина в сердце OVE26 подтверждалась ОТ-ПЦР (дополнительная фиг.5А). В возрасте 5 месяцев участки поперечного сечения кардиомиоцитов, уровни ANP и β-MHC мРНК и активность каспазы-3 были значительно увеличены у мышей OVE26 по сравнению с их однопометниками дикого типа (фиг.4A-D), показательными гипертрофии сердца. Не было различий в уровнях глюкозы в крови и массе тела и сердца между мышами OVE26 и Tg-CAST / OVE26 (дополнительная таблица 1); однако увеличение площади поперечного сечения кардиомиоцитов, экспрессии ANP и β-MHC и каспазы-3 в сердцах OVE26 нормализовалось у мышей Tg-CAST / OVE26 (фиг.4A-D). Эти результаты в модели OVE26 дополнительно поддерживают антигипертрофический эффект ингибирования кальпаина при сахарном диабете 1 типа.

Оценка сердечной гипертрофии у мышей OVE26. A-D: площади поперечного сечения кардиомиоцитов, уровни мРНК ANP ​​(B) и β-MHC (C) и активность каспазы-3 (D) увеличивались в OVE26 по сравнению с сердечниками дикого типа (WT), но были уменьшены в мышах Tg-CAST / OVE26. Активность E-H: NFAT и NF-κB была увеличена в OVE26 и STZ-инъецированных сердцах WT, но была уменьшена в сердцах Tg-CAST / OVE26 и Capn4 нокаутом (KO). Данные — среднее ± SD; n = 6-8. * P

Чтобы исследовать потенциальную сигнализацию нисходящего потока при гиперкальциемии, вызванной кальпаином, мы сосредоточились на двух факторах транскрипции: NFAT и NF-κB, которые играют центральную роль в регуляции сердечной гипертрофии (18,29-32). Общепризнанно, что кальцен-зависимая активация кальцинейрина серин / треонин протеинфосфатазы контролирует активность NFAT в кардиомиоцитах (18). Исследования также свидетельствуют о том, что кальпаин опосредует деградацию цитозольного ингибитора NF-κB, ингибитора κ Bα (IκBα), что является предпосылкой для активации NF-κB (33). В этом отношении мы измеряли активность как NF-κB, так и NFAT в OVE26 и Capn4 — / — диабетических сердцах. По сравнению с недиабетическим сердцем мышей дикого типа или Tg-CAST активность как NF-κB, так и NFAT была увеличена в OVE26 и STZ-инъецированных Capn4 + / + сердцах. Однако избыточная экспрессия кальпастатина у мышей Tg-CAST / OVE26 и делеция Capn4 у мышей Capn4 — / — STZ коррелировала со значительно сниженными действиями NF-κB и NFAT по сравнению с OVE26 и STZ-инъецированными Capn4 + / + сердцами (фиг.4E-H) , Эти результаты свидетельствуют о том, что система calpain / calpastatin может быть вовлечена в активацию путей NF-κB и NFAT в комплексной регуляции сердечной гипертрофии в диабетических сердцах.

Фиброз миокарда обычно наблюдается при диабетической кардиомиопатии и характеризуется чрезмерным продуцированием и накоплением внеклеточного коллагена (1,34). Для оценки фиброза ткани миокарда окрашивались пикрозириусом красного цвета, чтобы выделить коллаген. Измерялись отношения площади коллагена к общей площади. Осаждение коллагена было увеличено в STZ-индуцированных диабетических сердцах; однако делеция Capn4 у мышей Capn4 — / — и избыточная экспрессия кальпастатина у мышей Tg-CAST коррелировала со значительным снижением этих уровней после инъекции STZ (фиг.5A-C). В соответствии с измененным осаждением коллагена делеция Capn4 и избыточная экспрессия кальпастатина снижали уровни мРНК коллагенов I и III в диабетических сердцах Capn4 — / — и Tg-CAST соответственно (фиг.5Е и F и дополнительная фиг.6А). Аналогично, этот ингибирующий эффект делеции калпаина на фиброз миокарда наблюдался также через 5 месяцев после инъекции СТЗ (дополнительный рисунок 4C-E). Таким образом, ингибирование или целенаправленное разрушение кальпаина предотвращало фиброз миокарда в мышиной модели, индуцированной STZ, типа диабета 1 типа.

Оценка фиброза в диабетических сердцах. Отложение коллагена миокарда определяли окрашиванием красным пикоризиусом, а мРНК коллагена III определяли количественно RT-PCR в реальном времени. A: Репрезентативное окрашивание пикросириусом красного цвета для осаждения коллагена из диабетических сердец Capn4 — / — и Capn4 + / + (красный цвет). Отложение коллагена было снижено в сердцах Capn4 — / — (нокаут [KO], B), Tg-CAST (C) и Tg-CAST / OVE26 (D) по сравнению с диабетическим диким типом (WT), Capn4 + / + ( KO) и OVE26 диабетических мышей, соответственно. МРНК коллагена III была снижена у мышей с диабетом Capn4 — / — (E), Tg-CAST (F) и Tg-CAST / OVE26 (G). Данные — среднее ± SD; n = 8 до 9. * P

MMP играют ключевую роль в поддержании и деградации внеклеточного матрикса (ECM), что способствует процессу фиброза миокарда (35), поэтому мы затем измерили активность MMP в миокарде. STZ-индуцированный диабет коррелировал с 34-процентным увеличением общей активности MMP, но это увеличение было значительно снижено у пациентов с диабетом Tg-CAST и Capn4 — / — (фиг.6A и D). Поскольку MMP-2 и MMP-9 являются наиболее важными MMP в регуляции ремоделирования миокарда, мы измерили их активность в диабетическом сердце. Аналогично, активность MMP-2 и MMP-9 была снижена у мышей Tg-CAST и Capn4 — / — (фиг.6B, C, E и F). Роль ММР отрицательно регулируется тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (ТИМП). Поэтому мы также измеряли экспрессию TIMP-1 и TIMP-2 в диабетическом сердце. Уровни мРНК ТИМП-1 и ТИМП-2 были значительно увеличены при диабетическом Capn4 — / — по сравнению с мышами Capn + / + (фиг.6Н и I). Взятые вместе, наши данные свидетельствуют о том, что нарушение кальпаина может препятствовать активности ММР через подавление TIMP-1 и TIMP-2 в диабетическом сердце.

MMP и экспрессия TIMP в диабетических сердцах. Активность MMP определялась в сердцах Capn4 — / -, Tg-CAST и OVE26. A: Активность MMP была увеличена в диабетических сердцах. Сверхэкспрессия кальпастатина снижала общую активность MMP и активность MMP-2 и MMP-9 в сердечниках диабетического Tg-CAST (A-C). D-F: Дефицит Capn4 уменьшил общую активность MMP и активность MMP-2 и MMP-9 в Capn4 — / — (нокаут [KO]) по сравнению с недиабетическими сердцами дикого типа (WT). G: Общая активность MMP была увеличена в OVE26 по сравнению с сердечниками WT и уменьшена в сердцах Tg-CAST / OVE26. H и I: уровни мРНК TIMP-1 и TIMP-2 уменьшались в Capn4 — / — (KO) по сравнению с недиабетическими сердцами WT. Данные — среднее ± SD; n = 6-8. * P

Воспаление играет важную роль в фиброзе миокарда. Наше недавнее исследование показало, что экспрессия провоспалительных цитокинов коррелирует с фиброзом миокарда в диабетическом сердце (25). В соответствии с ингибированием фиброза миокарда делеция Capn4 значительно уменьшала экспрессию TNF-α и TGF-β1 в диабетическом Capn4 — / — по сравнению с мышами Capn4 + / + (фиг.7A и B). Кроме того, количество тучных клеток было увеличено в диабетическом сердце, которое было уменьшено у мышей Capn4 — / — (дополнительные фиг.7A и B).

Выражение провоспалительных цитокинов в диабетических нокаутных сердцах Capn4. Через пять месяцев после инъекции STZ уровни мРНК TGF-β1 (A) и TNF-α (B) в сердцах Capn4 — / — (нокаут, KO) и Capn4 + / + (дикого типа, WT) RT-PCR. Данные представляют собой среднее ± SD из шести разных сердец в каждой группе. * P

Мыши OVE26 также проявляли фиброз миокарда, определяемый увеличением осаждения коллагена (рис.5D), уровни мРНК коллагена I и коллагена III (фиг.5G и дополнительная фиг.6B) и повышение активности MMP (фиг.6G). Все эти признаки фиброза были нормализованы сверхэкспрессией кальпастатина у мышей Tg-CAST / OVE26. Эти результаты также свидетельствуют о защитных эффектах ингибирования кальпаина в диабетических сердцах у мышиных моделей диабета типа 1.

Чтобы получить дополнительную информацию о роли кальпаина в фиброзе, мы выделили и культивировали сердечные фибробластные клетки, которые являются предположительными медиаторами фиброза. Для имитации диабетического состояния в культивируемых фибробластах использовали высокий уровень глюкозы (30 ммоль / л). Высокий уровень глюкозы повышал кальпаин (рис.7C) и активность MMP (фиг.7D), а также пролиферацию клеток относительно нормальной глюкозы (5,5 ммоль / л, фиг.7Е и F). Эти эффекты были отменены ингибитором кальпаина-III. Последовательно, фибробласты из сердец Tg-CAST показали значительно меньшую активность MMP и меньшую пролиферацию клеток, чем фибриллы дикого типа в ответ на высокую глюкозу (фиг.7D-F). Эти эффекты ингибирования кальпаина коррелировали с изменениями активации NF-κB (фиг.7G). Дальнейшие доказательства in vivo, подтверждающие ингибирующее действие ингибирования кальпаина на пролиферацию фибробластов в диабетическом сердце, состоят в том, что 1) экспрессия α-гладкомышечного актина (α-SMA) была снижена при диабетическом Capn4 — / — по сравнению с мышами Capn4 + / + и 2 ) количество некардиомиоцитов было относительно меньше в диабетическом Capn4 — / -, чем в сердцах Capn4 + / + (дополнительный рисунок 7D и E). Таким образом, ингибирование активности ММР и уменьшение пролиферации фибробластов путем ингибирования кальпаина могут представлять собой важные механизмы для уменьшения фиброза в диабетических сердцах.

Продемонстрировав способность делеции кальпастатина и сердца Capn4 для обратной гипертрофии и фиброза кардиомиоцитов в диабетическом миокарде, мы выполнили измерения объема и давления внутривенно, а также функциональный анализ сокращения сердца и релаксации с использованием системы Лангендорфа в качестве продолжения этих результатов. Параметры гемодинамики были показаны в дополнительных таблицах 2 и 3. Как и ожидалось, анализ объемного давления показал значительное снижение максимальных положительных и минимальных отрицательных первых производных давления ЛЖ (+ dP / dtmax и -dP / dtmin) и увеличение жесткости ЛЖ в диабетические сердца. Однако эти изменения -dP / dtmin и жесткость были относительно ослаблены в диабетических Capn4 — / — и Tg-CAST по сравнению с их однопометниками дикого типа (рис.8A-D). Впоследствии уменьшение сердечного сокращения и релаксации также ослаблялось в изолированных трансгенах кальпастатина и нокаутом Capn4 после инъекции STZ (фиг.8E-H). Взятые вместе, целенаправленное разрушение calpain сохраняет функцию миокарда при диабетической кардиомиопатии STZ-индуцированного диабета типа 1.

Сердечная функция. Tg-CAST, Capn4 — / — (нокаут [KO]) и мышей дикого типа (WT) вводили STZ. Два (Tg-CAST) или пять месяцев (Capn4 — / -) после инъекции STZ выполняли гемодинамическое измерение in vivo. Показаны изменения в -dP / dtmin (A и C) и жесткости LV (B и D). Данные — среднее ± SD; n = 6-10 на группу. * P

Хотя кальпаиновая активность повышается в диабетическом сердце (14), ее патофизиологическое значение не полностью понято. В текущем исследовании мы создали новые мышиные модели, включая мышей с нокаутом Capn4 с сердечной недостаточностью и мышей OVE26 с избыточной экспрессией кальпастатина и исследовали роль кальпаина при диабетической кардиомиопатии. Мы наблюдали, что сердечно-специфическая делеция избыточной экспрессии Capn4 и кальпастатина снижает сердечную гипертрофию и фиброз у обеих пациентов с диабетом STZ-индуцированной и OVE26-типа 1, что приводит к улучшению функции миокарда. Учитывая тот факт, что избыточная экспрессия калпастатина и делеция Capn4 ингибируют только активность кальпаина-1 и кальпаина-2 из 14 известных изоформ млекопитающих (7), настоящее исследование показывает основную роль этих двух изотропных форм кальпаина при диабетической кардиомиопатии.

Важным клеточным признаком диабетической кардиомиопатии является сердечная гипертрофия (1,5,36). На начальных этапах увеличение кардиомиоцитов может быть адаптивным ответом, предназначенным для улучшения работы желудочков (37). Однако устойчивый гипертрофический рост миокарда может быть связан с патологическим ремоделированием ЛЖ (37). Недостаточно понятна роль кальпаина в сердечной гипертрофии. Недавнее исследование показало, что трансгенная избыточная экспрессия кальпастатина снижает гипертрофию миокарда на мышиной модели гипертонической болезни, вызванной ангиотензином-II (38), что указывает на то, что кальпаин может быть фактором, влияющим на гипертрофию сердца. Препятствовав функции calpain, мы наблюдали четкое изменение сердечной гипертрофии как у STZ-индуцированных, так и у диабетических мышей типа OVE26 типа 1. Эти данные свидетельствуют о том, что кальпаны могут играть роль в сердечной гипертрофии диабетической кардиомиопатии. Мы также показали, что активация калпаина коррелирует с повышенной активностью NFAT и NF-κB, каждый из которых опосредует пути транхпертрофического сигнального пути (18,19,39,40). Действительно, кальпаин был идентифицирован как ключевой активатор пути NF-κB, приводящий к гипертрофии миокарда при гипертензии, вызванной ангиотензином-II (38). Таким образом, резкое снижение уровней активности NF-κB в диабетических сердцах после удаления Capn4 и избыточной экспрессии кальпастатина подчеркивает важность этого пути при диабетической кардиомиопатии (41). Было показано, что кальпаин деградирует IκB, ингибитор NF-κB, который позволяет NF-κB свободно перемещаться в ядро ​​и транскрибировать прогипертрофные гены, такие как β-MHC. Поэтому мы постулируем, что ингибирование кальпаина будет увеличивать IκB и ограничивать ядерную транслокацию NF-κB, тем самым ограничивая гипертрофию сердца в диабетических сердцах. Кальпаин также активирует кальциневрин, который является еще одним важным медиатором сердечной гипертрофии (19,20). Активированный кальцинейрин дефосфорилирует NFAT, который связывается с GATA-4 при ядерной транслокации и дополнительно увеличивает ответ транскрипции, приводящий к гипертрофии миокарда (19). В связи с этим мы показали, что ингибирование кальпаина снижает активность NFAT в диабетических сердцах, что указывает на то, что путь кальциневрина / NFAT является дополнительным механизмом, посредством которого кальпаин опосредует сердечную гипертрофию при диабетической кардиомиопатии. Эти результаты контрастируют с недавним исследованием, которое продемонстрировало, что путь NFAT не участвовал в ингибировании гипертрофии миокарда сверхэкспрессией кальпастатина при гипертензии, вызванной ангиотензином-II (38). Разница между этими двумя исследованиями показывает, что кальпаин может опосредовать гипертрофию сердца через множественные механизмы в зависимости от основных патологических состояний.

Фиброз является еще одним важным признаком диабетической кардиомиопатии (1,5,36). Считается, что это неадекватный ответ, не зависящий от клеточной гипертрофии, который характеризуется избыточным накоплением коллагена (1,5,36). Мы последовательно наблюдали, что осаждение миокардиального коллагена было значительно увеличено как у пациентов с сахарным диабетом типа 1, так и с помощью СТЗ-индуцированных и OVE26. Следует отметить, что как сердечно-специфическая делеция Capn4, так и избыточная экспрессия кальпастатина снижают уровни осаждения и экспрессии коллагена основных компонентов ECM, коллагенов I и III. Этот вывод свидетельствует о том, что кальдеин, вырабатываемый кардиомиоцитами, может способствовать фиброзу через косвенные (паракринные) или прямые механизмы. Однако вполне вероятно, что кальпаин у некардиомиоцитов может также играть важную роль при фиброзе миокарда при диабете, поскольку мыши Tg-CAST продемонстрировали значительное снижение перихоксиального фиброза в ответ на стимуляцию ангиотензина II по сравнению с мышами дикого типа (38). Кроме того, значительное снижение индуцированного ангиотензином синтеза и секреции коллагена происходило в сосудистых гладкомышечных клетках у мышей Tg-CAST по сравнению с мышами дикого типа (38).

Фибропласты играют важную роль в фиброзе (42). Сердечные фибробласты могут дифференцироваться в миофибробласты, которые индуцируют пролиферацию фибробластов. В нашем недавнем исследовании показано увеличение миофибробластного маркера α-SMA в диабетических сердцах (25), что указывает на возможную дифференциацию миофибробластов. В связи с этим мы продемонстрировали значительное снижение экспрессии α-SMA в диабетических сердечниках нокаута Capn4. В соответствии с подавлением экспрессии α-SMA количество некардиомиоцитов уменьшалось при диабетическом Capn4 — / — по сравнению с мышами Capn4PZ / PZ. Кроме того, культивируемые сердечные фибробласты подвергаются значительной гиперплазии в ответ на высокую глюкозу, и это было уменьшено за счет ингибирования кальпаина. Пролиферация фибробластов индуцируется рядом факторов, включая, возможно, NF-κB. Доказательства предполагают, что на комплекс IκB-NF-κB влияет активация калпаина, что может способствовать развитию диабетической кардиомиопатии посредством стимулирования фиброза (43,44). В частности, NF-κB требуется для индукции провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α, который также сверхэкспрессируется в диабетическом сердце (25, 40). Провоспалительные цитокины могут дополнительно индуцировать экспрессию цитокинов, таких как TGF-β1, который также повышен в диабетическом сердце (25), и, как известно, является профиброгенным индуктором (45). Действительно, наши данные показали, что делеция Capn4 уменьшала экспрессию TNF-α и TGF-β1 в диабетическом сердце. Профиброгенный эффект этих цитокинов может также включать активацию MMP. Деформация активности ММР изменяет баланс между синтезом и деградацией ECM, что приводит к чрезмерному осаждению коллагена и снижению структурной целостности миокарда (35). Исследования показали усиление активности MMP-9 (46) и снижение активности MMP-2 в диабетическом сердце (47). Было высказано предположение, что ингибирование активности ММР является сердечной защитой при диабете (48). В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что общая активность MMP была увеличена как в фибробластах in vitro в ответ на высокую глюкозу, так и в диабетическом сердце in vivo, что в обоих случаях было отменено ингибированием кальпаина. В частности, ингибирование кальпаина также уменьшало активность MMP-2 и MMP-9 в диабетическом сердце. Этот вывод показывает связь между кальпаином и ММР в диабетических условиях. Предварительная работа предполагает, что кальпаин индуцирует активность MMP-9 в гомецистеин-стимулированных сердечно-сосудистых эндотелиальных клетках (49). Взятые вместе с нашими результатами, общая роль кальпаина в модуляции композиции ECM в сердце, вероятно.

В настоящее время неизвестно, способствуют ли гемопоэтические клетки фибротическим процессам в наших моделях диабета типа 1. Экспрессия CD68, маркера макрофага, была сопоставима между диабетическими сердцами Capn4 — / — и Capn4PZ / PZ (дополнительный рисунок 6C), потенциально исключающим участие инфильтрации макрофагов в ингибирующем эффекте делеции Capn4 при диабетическом фиброзе миокарда. Тем не менее, мы продемонстрировали, что количество тучных клеток было увеличено в диабетическом сердце, что было значительно снижено в Capn4 — / — по сравнению с мышами Capn4PZ / PZ. Независимо от того, играет ли это снижение тучных клеток в ингибирующем эффекте делеции Capn4 при диабетическом фиброзе миокарда, выходит за рамки этого исследования и заслуживает изучения в будущем.

Таким образом, настоящее исследование продемонстрировало, что целевое ингибирование кальпаина защищает от гипертрофии и фиброза, двух общих признаков диабетической кардиомиопатии и сохраняет функцию миокарда в мышиных моделях диабета 1 типа. Эти эффекты ингибирования кальпаина можно опосредовать через NFAT-, NF-κB- и MMP-зависимые сигнальные пути. Сердечная гипертрофия и отложение коллагена, в частности коллагена I и III, были связаны с сердечной дисфункцией при диабете (1,5,36) и были восстановлены путем ингибирования кальпаина, тем самым поддерживая важное функциональное значение in vivo системы calpain / calpastatin в диабетическом сердце. Таким образом, кальпаин может быть потенциальной терапевтической мишенью для диабетических заболеваний сердца.

Эта статья содержит дополнительные данные в Интернете по адресу http://diabetes.diabetesjournals.org/lookup/suppl/doi:10.2337/db10-1333/-/DC1.

Это исследование было поддержано операционным грантом, присужденным T.P. из Канадских институтов исследования сердца (MOP93657). T.P. является получателем премии New Investigator от Фонда Heart & Stroke Канады.

Не сообщалось о потенциальных конфликтах интересов, имеющих отношение к этой статье.

Y.L., J.M. и H.Z. исследуемые данные. МИЗ. исследовал данные, написал и отредактировал рукопись. Д.Х. написал рукопись, рассмотрел рукопись и внес свой вклад в обсуждение. P.A.G. способствовали мышам Capn4PZ и рассмотрели рукопись. J.M.A. способствовали обсуждению и рассмотрению рукописи. E.D.A. помогли мышам MHC-Cre и обсудили, рассмотрели и отредактировали рукопись. T.P. исследовал данные и написал, рассмотрел и отредактировал рукопись.



Source: rupubmed.com


Добавить комментарий